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其他細胞培養(yǎng)用液

 

在細胞培養(yǎng)過程中,除了培養(yǎng)基外,還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。

一、平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS:

主要是由無機鹽、葡萄糖組成,它的作用是維持細胞滲透壓平衡,保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡單的BSSRingerD-Hank'sHank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件,Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3,不能用于5%CO2的環(huán)境,若放入CO2培養(yǎng)相,溶液將迅速變酸,使用時應注意。

配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+Mg2+,應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液:

取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液,傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有時也用膠原酶(collagenase)溶液。

1.胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常見有11251250,即一份胰酶可消化125250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度,配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液(如前面的D-Hank's),因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH8-9,配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右,充分溶解,過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5,也可不調。

使用細胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的細胞清洗液(100ml細胞清洗液加0.5g胰酶),過濾除菌,分裝于4度保存。

2.EDTA溶液:

EDTA溶液也常用來解離細胞,它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞,還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%,配制時應加堿助溶,配制后可過濾除菌,也可高溫消毒滅菌。

3.膠原酶溶液:

膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經常使用,膠原酶作用的對象是膠原組織,因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L200000U/L,作用的最佳pH6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制時可用PBS。

三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1.NaHCO3溶液:

NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分,一般情況下按說明書的要求準確添加,以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養(yǎng),即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡,所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%7.4%NaHCO3溶液調節(jié)培養(yǎng)基,使之達到所要求的pH環(huán)境。

2.HEPES溶液:

是一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,對細胞無毒性,主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下,觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境,CO2氣體迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

四、抗生素:

常用的是青鏈霉素,俗稱雙抗溶液。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效,鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液,可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補充液:

谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用,合成培養(yǎng)基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,4下放置7天即可分解約50%,所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液(含谷氨酰胺)在4放置2周以上時,要重新加入原來量的谷氨酰胺,故需單獨配制谷氨酰胺,以便臨時加入培養(yǎng)液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液,即濃度為200mmol/L29.22g/L),配制時應加溫30,完全溶解后過濾除菌,分裝至小瓶,儲存于-20。使用時,在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液,終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)

在細胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養(yǎng)基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸,在中性的水溶液中會自發(fā)降解;需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過程中經常:
1)頻繁打開蓋子,增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性;
2)過多的追加L-谷氨酰胺,增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

    二肽谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!

    二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,產生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分細胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物,它無需適應;既可用于貼壁細胞培養(yǎng),也適合于懸浮細胞的培養(yǎng)。

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