細(xì)胞運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式： （1）干冰運(yùn)輸，收到后 立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇； （2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì) 胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

 

細(xì)胞用途：僅供科研使用。

 

細(xì)胞接收后的處理：

1） 收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì) 胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2） 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，最好在低倍鏡（4 或 5X 物鏡)下進(jìn)行，能 準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度。看細(xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?10X 和 20×物鏡下，同時(shí)給剛收 到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各 2-3 張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì) 胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）觀察好細(xì)胞狀態(tài)后， 75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4） 貼壁細(xì)胞：在運(yùn)輸過(guò)程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落 或者脫落后抱團(tuán)生長(zhǎng)，可將 T25 瓶置于 37℃培養(yǎng)箱放置約 2-3h，然后抽出瓶中 的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞 1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照 說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5） 懸浮細(xì)胞：T25 瓶置于 37℃培養(yǎng)箱放置約 2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和 細(xì)胞 1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說(shuō) 明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基）。

6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō) 明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后第一次傳代建 議 1：2 傳代 。

 

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備 L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%，MEMNEAA 非必 需氨基酸 1%

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，100%；該細(xì)胞培養(yǎng)不能通入 CO2，如果沒(méi)有條件 準(zhǔn)備空氣氣相 100%的培養(yǎng)箱的，可以采用不透氣密封蓋的 T25 培養(yǎng)瓶來(lái)培 養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每天將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱換 1-2 次空氣。溫度：37 攝氏度，培 養(yǎng)箱濕度為 70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢 查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。 2. 加 2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部 分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止 消化。 3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。 4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者 瓶中。 注：第一次傳代推薦傳代比例為 1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。 3） 細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄 去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約 1ml 含血清的培養(yǎng)基后 加入凍存管中，再添加 10%DMSO 后進(jìn)行凍存。 下面 T25 瓶為例； 1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗瓶底 1-2 次后加入 1ml 胰酶，細(xì) 胞變圓脫落后，加入 2ml 完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 2．1000RPM 離心 5 分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加 DMSO 至最終濃度 為 10%。加入 DMSO 后迅速混勻，按每 1ml 的數(shù)量分配到凍存管中，注意 凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于 1X106個(gè)細(xì)胞凍存。 3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液 氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項(xiàng)： 1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即 與我們聯(lián)系。 2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意 防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。